九年级化学实验总结 本文关键词：九年级，化学实验
九年级化学实验总结 本文简介：九年级化学实验教学工作总结吴海霞根据《九年级化学教学课程标准》及学校对化学教学的具体要求，针对我所代的两个班学生自身的知识基础及学习特点，有计划地开展了本学期化学实验教学。化学是一门以实验为基础的自然学科。实验教学可以帮助学生形成概念、理解和巩固化学知识，培养学生观察现象、提出问题、分析问题和解决问
九年级化学实验总结 本文内容：
九年级化学实验教学工作总结
吴海霞
根据《九年级化学教学课程标准》及学校对化学教学的具体要求，针对我所代的两个班学生自身的知识基础及学习特点，有计划地开展了本学期化学实验教学。
化学是一门以实验为基础的自然学科。实验教学可以帮助学生形成概念、理解和巩固化学知识，培养学生观察现象、提出问题、分析问题和解决问题的能力；帮助学生掌握一些常用的化学学实验的基本技能，培养学生实事求是、严谨细致的科学态度和科学方法。多年的教学实践告诉我们：化学实验教学过程中要始终坚持三个基本原则，即：客观性原则；严谨认真的原则；尊重学生，灵活引导的原则。在实验教学过程中，演示实验和分组实验实验开出率达到了100%。工作总结如下：
一、尊重客观规律，坚持实事求是。
在平时的学生实验中，经常出现这种现象：当实验得不到正确结果时，学生常常是马虎应付，实验课堂一片混乱，铃声一响学生不欢而散；当老师催要实验报告时，他们就按课本上的理论知识填写实验报告；还有的学生在规定时间内完不成该做的实验项目，就抄袭他人的实验结果，或凭猜测填写实验结论等等。这样就不能达到实验教学目标。可见，对化学实验教学，必须要加强理论学习，提高实验教学技能，树立严谨细致、认真科学的态度，要尊重客观规律，实事求是，实实在在地引导学生完成实验教学的任务，才能达到理想的目的。
二.认真完成实验环节，注重操作引导。
在实验教学工作中，无论是实验员准备实验，教师演示实验，或者指导学生实验，以及对待实验的严格态度等方面，处处、时时、事事都要体现教师的言传身教，只有教师教得扎实，学生才能学得牢固。因此，严格搞好实验课的“备、教、导”是上好实验课不可或缺的基本环节。
1、备好实验课是上好实验课的首要前提教材中要求做的实验，无论简单也好复杂也好，都必须要备好课，写好切实可行的教案，并且在实验课之前要亲自动手做一遍，即预备实验。教师做了，才可能指导学生如何应对操作过程中每一个细节可能出现的问题，看到实验现象，学到真正的实验方法和科学知识，培养学生发现问题、解决问题的能力；若不备课，不亲自做实验，凭空想象，黑板上做实验，那就没有明显效果，更没有说服力了。甚至会出现，全体学生实验失败等不该发生的现象。
2、注重实验引导。指导学生实验时，既要面面俱到，事无俱细进行引导，同时，又要注意切忌包办代替。从实验材料的选择、仪器的装配到操作步骤和技巧，既要科学规范，又要密切结合具体实际，在尊重学生主体地位的同时，充分发挥教师的引导作用，以保证现象清晰，结果正确。
3、注重实验结果的分析与小结。要求学生，在填写实验报告时，要如实填写。实验失败时，要如实地与学生一起分析失败原因，可课后补做。如果学生实验失败，我们就通过示范帮助学生掌握操作技能，取得实验成功，或帮助分析失败原因让学生重做，直至成功。不能听之任之，否则，就达不到实验课的预期目的。
综上所述，化学课实验，无论教还是学，都必须坚持客观、严谨、认真、扎实的作风，教师才能教好，学生才能学好；也只有这样，才能真正发挥实验教学的作用，达到预期的教学目的和效果。
篇2：九年级化学实验教学工作总结
九年级化学实验教学工作总结 本文关键词：工作总结，九年级，实验教学，化学
九年级化学实验教学工作总结 本文简介：九年级化学实验教学工作总结化学实验教学是化学教学中学生获得化学知识和检验化学知识的重要媒体和手段，能为学生形成化学基本概念和化学基础理论提供感性认识的材料，能激发学生的学习兴趣，因此，化学实验教学是化学教学的一个重要内容，在整个化学教学中起着很重要的作用。本年度，化学实验教学取得了一些新的进展，具体
九年级化学实验教学工作总结 本文内容：
九年级化学实验教学工作总结
化学实验教学是化学教学中学生获得化学知识和检验化学知识的重要媒体和手段，能为学生形成化学基本概念和化学基础理论提供感性认识的材料，能激发学生的学习兴趣，因此，化学实验教学是化学教学的一个重要内容，在整个化学教学中起着很重要的作用。本年度，化学实验教学取得了一些新的进展，具体总结如下：
（一）、学生学习化学的兴趣得到激发，学生学习化学的主动性和积极性不断提高
初中三年纪的化学教学是化学教育的启蒙阶段。初中学生好奇心强，他们学习化学的动机往往是以满足好奇心和感兴趣为主的。化学实验教学的首要任务是如何激发学生对学习化学的兴趣，并使这种“短暂”的兴趣能够稳定地保持并得以发展，从而提高他们学习化学的主动性和积极性。我们在教学中主要抓以下几个环节。
1．加强演示实验教学
课堂教学中的演示实验，最能调动学生的情绪，激发他们学习的兴趣和求知欲。为此，对于大纲规定的每个演示实验我们都认真完成，并力求做到演示操作规范、实验现象明显、分析表述准确简练。对部分演示实验装置或实验操作还作了适当的补充和改进，以增强实验效果。有时根据教材的需要适当补充一些书本上没有的演示实验，例如在探究燃烧的条件的教学中，补充了白磷的燃烧演示实验，并用二连
球向烧杯的热水中缓缓通入空气，可看到热水中的白磷与空气接触后，也开始燃烧，产生火光。演示结束后，要求学生思考3个问题：
（1）．为什么铜片上的白磷能燃烧，红磷不能燃烧？
（2）．水中的白磷需要什么条件才能燃烧？
（3）
．红磷能不能燃烧？接着再补充演示红磷燃烧的实验，将少量红磷放在铁纱网上，直接在酒精灯火焰上加热，请学生观察红磷在空气中燃烧的现象，最后指导学生根据此实验，归纳总结出燃烧的条件。学生反映这样学既能理解，又记得牢。
（4）
2．努力开足学生实验
根据教学进度努力开足学生实验。学生实验做到每4人一组，位置固定，每次实验都进行登记，并对每个实验从课堂纪律、操作规范、整理仪器等方面对每一个学生打分。一学年下来，教学效果较好，完全改变了以前那种实验课上乱轰轰的教学场面，学生形成了良好的实验习惯；对于一些较简单的演示实验，根据条件把它改为学生实验，使学生积极主动地获取知识，激发学生学习兴趣。
3．开发家庭小实验
配合教学内容，每逢放假，都向学生布置一些既有浓厚生活气息又与所学化学知识密切相关，同时学生在家中又能够找到材料，独立完成的家庭小实验，并要求学生把观察到的现象，得出的结论与所学知识的联系都详细记录下来，回校后在课上进行交流，多数学生都能达到老师提出的要求。例如，把教材中铁钉生锈演示实验当作家庭小实验，提前一周布置给学生在家里做。到了上“金属的防护和回
收”这节课时，将实验室预先做好的铁钉生锈实验的五支试管展示给学生看，并请他们与自己所做的家庭小实验结果对照，学生很自然就接受了“铁在潮湿的空气中能够发生化学反应，生成铁锈”这一事实。进而再请学生思考：“一半浸在水中的铁钉，哪一部分锈斑最明显，为什么？”启迪学生对教材里讨论题“使铁生锈的主要原因有那些？”进行探究，从而对铁生锈的原因和防止铁生锈的方法有较深入的了解。十几个家庭小实验的开发，不仅丰富了学生的课余生活，使学生扩大了视野，培养了动手实验能力和观察分析能力，而且由于它们与课堂教学内容同步，也对知识的理解和巩固起到促进作用。
4．开展课外实验活动
根据我校的实际情况，鼓励学生多动手、多动脑、多实验??兴趣的激发大大提高了学习的主动性和积极性。我们还结合教学实际，指导学生进行社会调查，如学习水是人类宝贵的自然资源时，要求学生调查了解“你家附近的河水清澈吗？请问你们父母，在他们当学生时，这条河是不是像现在这样脏？让学生利用家庭厨房里现有的物品进行实验、观察，如观察没擦干净的铁锅、菜刀表面留下的锈斑；用久的热水瓶胆和烧水壶内沉积的水垢；比较食盐和白糖溶解性的大小；将鸡蛋放入盛食醋的茶杯中观察蛋壳表面产生的气泡以及限用厨房内的用品来鉴别精盐和碱面（NaHCO3）等。通过这些活动使学生感到化学就在自己身边，化学与生产、生活、社会密切相关，在一定程度上增强了他们关心自然、关心社会的情感。
（二）、指导科学的学习方法，养成良好实验习惯，培养学生的能力和创新精神
初中化学实验教学中注意使学生养成良好的实验习惯，是培养学生科学态度的重要措施。良好的实验习惯应包括：正确使用仪器、规范的实验操作、认真观察并记录实验现象、如实完成实验报告、遵守实验室规则、注意节约药品和实验安全等。在教学中注意从科学态度、规范操作上给学生进行示范，对学生遵守实验室规则提出严格要求，对如何观察、记录、实验现象、填写实验报告则加以具体指导。例如，学生在做“酸的性质”学生实验时，对盐酸与带锈铁钉的反应，在实验过程中不仅可看到铁钉表面的锈斑被盐酸所溶解，铁钉表面变得光亮，而且由于使用的盐酸过量，过量的盐酸和铁会继续发生反应，还可以看到铁钉表面有气泡冒出的现象。因此，在填写实验报告时，我要求学生将实验所观察到的所有现象如实填出并对所产生的现象作出相应的解释，以此来培养学生实事求是的科学态度。每次实验结束，我们都要留出3－5分钟，让学生清洗实验仪器、整理药品，保持桌面整洁，养成良好的实验习惯。
通过本学年的实践，化学实验使学生学习化学的兴趣很大，让学生在动中学、做中学、乐中学、趣中学，致使学生的多种能力和素质在一次又一次的提高。
篇3：生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文关键词：层析，分子量，凝胶，测定，蛋白质
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文简介：生物化学实验报告姓名：专业：院系：学号：实验一蛋白质分子量测定------凝胶层析法1、实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过
生物化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等 本文内容：
生物化学实验报告
姓名：
专业：
院系：
学号：
实验一
蛋白质分子量测定------凝胶层析法
1、
实验原理
凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。
以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。
洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：
Ve=Vo+KdVi
式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：
Kd=(Ve-Vo)/Vi
上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。
Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况：
1、
当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。
2、
当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和。
可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。
3、
当01时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脱体积远超过理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在Sephadex
G-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。
在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合牢固，称为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g.WR计算，此为也常有直接用小分子物质D2O,NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav代替Kd，其定义如下：
已知
Kd=（Ve-Vo）/Vi,Vt-Vo代替Vi,则：
Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)
即
Va=Vo+Kav(Vt-Vo)
在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：
Ve=K1-K2logM
K1和K2为常数，M为分子量，Ve也可用Ve-Vo,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同，通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征，在允许的工作范围内，曲线逾陡，则分级逾好，而工作范围逾窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有自己得特殊的选择曲线，可用以测定未知的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。
用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后测定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在PH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端PH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测得分子量的结果，要和其他方法测定相对照，由此可以得到可靠的结论。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性的变化，目前得到广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源动物以及用于测定高分子物质的分子量。
二、实验步骤
1、
将实现准备好的凝胶缓慢的注入层析柱中，注意连续加入凝胶不要使凝胶柱出现断层，凝胶柱中不能出现气泡；
2、
待层析柱中凝胶注满后，计算每分钟层析柱下滴液体的滴数，调节液滴下滴速度，再计算液滴滴满2ml时所用的时间，记下该时间；
3、
加样。用胶头滴管吸取0.8ml样品（蓝色葡聚糖酶，牛血清酶，胃蛋白酶，细胞色素C）缓慢的滴入层析柱内凝胶的表面，上面用洗脱液灌满，同时打开蛋白质核酸层析仪，设定好收集满2ml液滴所用时间。记下依次加入样品时所收集的洗脱液的体积。
4、
测定收集的洗脱液在280nm时的吸光值
5、
以洗脱体积为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制选择曲线。
3、
实验结果
1、
吸光度测定结果
表
1
第一次加样
第二次加样
第三次加样
第四次加样
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
编号
吸光度
1
0.043
7
0.195
13
0.051
19
0.07
25
0.039
31
0.068
2
0.053
8
0.446
14
0.114
20
0.049
26
0.049
32
0.049
3
0.059
9
0.134
15
0.121
21
0.041
27
0.099
33
0.037
4
0.064
10
0.063
16
0.067
22
0.039
28
0.189
5
0.06
11
0.064
17
0.067
23
0.04
29
0.201
6
0.065
12
0.055
18
0.151
24
0.037
30
0.128
2、绘制洗脱曲线
以洗脱体积为横坐标，OD值为纵坐标绘制洗脱曲线如下。
图
1
3、绘制标准曲线
表
2
Ve
OD
M
lgM
4
个
峰
值
16
0.446
200
2.30103
30
0.121
67
1.826075
36
0.151
36
1.556303
58
0.201
13.7
1.136721
以蛋白质分子量的对数lgM为横坐标，Ve为纵坐标，绘制标准曲线如下。
图
2
4、
实验结果分析
1、实验过程中加样是很关键的步骤，加样太快容易造成重叠峰。
2、
洗脱曲线四个峰值明显，表明四种蛋白质样品被有效的分开。
3、
A样和B样，C样和D样之间洗脱体积差异不太大，有可能是后一个样加样时间提早了得缘故，致使两峰值之间的间距较小，会有分离不出，两峰重叠的可能。
4、
根据蛋白质摩尔质量的对数和洗脱体积所作的标准曲线不是一条直线，可能是洗脱体积的误差。如果在实验过程中，收集洗脱液时出现气泡，会严重影响洗脱体积的计算，造成洗脱体积的计算不准确，从而造成误差。蛋白质分析仪也有可能造成机械误差。
5、
从标准曲线看出，蛋白质的分子量所对应的洗脱体积偏小，最有可能造成的误差就是在洗脱蛋白质时出现气泡。为解决这一问题，可以多测量几次洗脱体积，取品均值后再作图案，可以减小误差。
实验二
小麦种子储藏蛋白—HMW-GS的分离（SDS-PAGE）
一、实验目的
利用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究小麦种子储藏蛋白C高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成结构。此外，SDS-PAGE也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法。通过本实验，掌握SDS-PAGE的基本原理、技术及应用。
二、实验原理
用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二流苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构象均呈长棒状，各种蛋白质亚基-
SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中迁移速度仅与分子量有关。因此，SDS-PAGE可以用来分离蛋白质亚基并测定其分子质量。
三、实验器材及试剂
1.仪器
电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、烧杯50ml
2个，移液管
2.试剂和材料
70%乙醇、50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ml、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液（Tris-HCl）pH8.8、浓缩胶缓冲液（Tris-HCl）pH6.8、10%AP溶液、染色液、漂洗液
四、操作步骤
1、样品的提取
（1）取一粒种子研磨粉碎，加入70%乙醇1000ul，10分钟后，12000转离心8分钟；弃乙醇晾干。
（2）加50%正丙醇（含2%β-巯基乙醇）250ul混匀后，50℃水浴1.5小时，中途需震荡，12000转离心8分钟。
（3）取上清夜加3倍体积丙酮置于-20℃＞3小时。
（4）12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸2.5分钟，之后12000转再离心1分钟，上清液用于点样。
2、SDS-PAGE分析
（1）组装电泳槽：见电泳槽使用说明书
（2）凝胶的制备：
取两只干净烧杯（500ml）标号，按下表试剂配方惊醒制胶。在组装好的电泳槽中先制分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。分离胶用量15ml，浓缩胶用量5ml。
表1
凝胶的制备试剂配方
聚丙烯酰胺凝胶组成
分离胶（10%）
浓缩胶（3%）
30%Acr-Bis（ml）
H2O
pH8.8Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）
pH6.8
Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）
10%AP（ul）
2.5
2.95
2.0
0
100
0.62
3.0
0
1.3
75
（3）加样及电泳
待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子，然后将电泳槽注满电泳缓冲液，取适量上清液加样，在标准泳道点是上高分子标准蛋白质溶液。上槽接负极，下槽接正极，恒流200mA电泳。待溴酚蓝走出分离胶后30分钟停止电泳，取出玻璃板，剥胶染色。
（4）染色
剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色4次，每次1分钟，取出震荡，取出。
（5）脱色
将染色液倒回瓶内，加入漂洗液洗，漂洗两次，每次1-2小时，照相保存。
五．实验结果分析
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到四条大小不同的条带分离出蛋白质亚基并可知道其亚基的分子量，条带不是很平整可能是梳子没有插好，导致点样不好，也可能是本身做胶就不够好，使得条带不够整齐清晰。
实验三
猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定
一、实验目的
通过本次实验熟悉掌握超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化方以及SOD活力的测定。
二、实验原理：
超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧阴离子自由基（O2-）的金属酶,它具有抗衰老，抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业具有广泛的应用前景。
SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它含的金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫色；Fe-SOD呈黄褐色。
SOD催化下述反应：2H++2O2-→H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。
本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可以用一下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。
该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应溶液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%的酶量定义为一个酶活单位。
样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈蓝色。在一定的范围内，溶液在595nm波长下光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，在测定范围1-1000ug。
SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮唑蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，经电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显色为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱。
三、
操作步骤
1、
SOD的提取
（1）
取新鲜猪血20ml（预先按0.5:1的比例加入ACD抗凝剂），4000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上清液，得洗净的红血球浓稠液。
（2）
向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均匀呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。然后将清液在65-70°C恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min，除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。
（3）
向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置4h，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥既得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。
2、
SOD活力测定
（1）邻苯三酚自氧化率的测定
取4.5ml
50mmol/L
PH
8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml
10mmol/L
EDTA-Na2溶液，混匀后在25°C水浴保温20min，取出后立即加入25°C预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L
HCl作空白，325nm波长下每隔30s测定光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.07/mim左右。
（2）
酶活力测定
操作与（1）基本一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。
（3）酶活性单位的计算
根据酶活单位定义，按下列公式计算酶活性：
单位活性（U/ml）=(((A0-Am)/A0*100%)/50%)*反应液总体积数*（样液稀释倍数/样液体积）
总活性（U）=单位活性测定*酶原液总体积
（4）蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法）
标准曲线的制作：取6支试管，编号，按下表加试剂：
表1.各试管加样量及对应蛋白质含量
试剂
管
号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250(ml)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（ug）
0
20
40
60
80
100
盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。
样品中蛋白含量的测定
将待测的SOD溶液并稀释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。
蛋白质含量计算
根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含
量，计算其浓度。
3、
实验结果
1.测得邻苯三酚自氧化率：
表
3
时间(min)
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
A
0.018
0.060
0.098
0.134
0.167
0.200
0.232
0.261
图
3
计算得：A0=0.069/min。
酶活力测定中三个不同量样液的光密度值见下表：
表
4
时间(min)
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
样1(50μl)
0.208
0.217
0.225
0.232
0.242
0.249
0.258
0.264
样2(100μl)
0.068
0.073
0.079
0.084
0.088
0.093
0.099
0.104
样2(100μl)
0.051
0.053
0.054
0.055
0.057
0.061
0.062
0.064
计算（方法同1）得：
A1=0.016/min；A2=0.0103/min；A3=0.004/min。
酶活性单位的计算：
单位活性（U/ml）=
表
5
样液体积(ml)
酶原液总体积(ml)
Am
单位活性(U/ml)
总活性(U)
样1
0.05
14
0.016
314.8936
4408.511
样2
0.1
12.5
0.0103
172.6064
2157.58
样3
0.1
5
0.004
189.3617
946.8085
（1）
标准曲线的制作
表4.标准曲线制作各试管加样量及光密度值
试剂
管
号
1
2
3
4
5
6
蛋白质标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
考马斯亮蓝G-250(ml)
5
5
5
5
5
5
蛋白质含量（ug）
0
20
40
60
80
100
光密度值（A595）
0
0.174
0.341
0.452
0.620
0.729
图2.蛋白质含量标准曲线
（2）
样品蛋白质含量
样品光密度测定值及蛋白质含量的计算结果如下表：
表
6
样号
A595平均值
蛋白质含量(μg)
蛋白质浓度(μg/μl)
样1
0.287
36.63186
1.8316
样2
0.171
19.17618
0.1918
样3
0.1185
11.27598
0.1128
（3）
数据处理
表
7
提纯步骤
酶液总体积ml
蛋白质mg/ml
酶活性U/ml
总活性U
比活性U/mg
回收率%
纯化倍数
除血蛋白上清
14
1.8316
314.8936
4408.51
171.92
100
1
热变性后上清
12.5
0.1918
172.6064
2157.58
899.93
48.94
5.23
丙酮沉淀后
0.0117(g)
0.1128
189.3617
946.81
1678.74
21.48
9.76
4、
实验结果分析
1、
蛋白质含量标准曲线不是一条直线，可能是由于分光光度计的读数误差，也有可能是认人为误差。解决方法，可以多次测量取平均值，再舍去离标准曲线较远的点，使标准曲线两边的点数目尽量一样多，再绘制标准曲线，这样就可以减少偶然误差。
2、
样品一的蛋白质含量过高，从后面的电泳图也可以看出样品1混有杂质，说明分离SOD同工酶时细胞可能有溶血。里面含有杂质，所以吸光值较大在标准曲线上所对应的蛋白质含量就过高，所以样品1的蛋白质含量不准确。
3、
表3中邻苯三酚的自氧化率没有达到0.07/mim,可能会对后续实验结果造成影响，最大的影响就是使得所测样品中SOD同工酶抑制邻苯三酚的自氧化率会减小，从而计算出来的酶活性相应减小。
4、
本实验纯化过程中，蛋白质含量、酶总活性逐渐降低，比活性逐渐增加。而酶活性本应随着酶纯度的增加而增大，但本实验没有这样的现象。SOD纯化倍数逐渐增加，最后达到约10倍，但是回收率却只有21%，偏低。说明本实验还存在很多问题，在操作时需要注意。
20
